Funktionelle Charakterisierung von Punktmutationen im Bereich des Selektivitätsfilters von TRPV6

Abstract

Kalzium (Ca2+) ist ein essentieller Mineralstoff mit strukturellen und signalvermittelnden Funktionen bei Prozessen wie Signaltransduktion, Immunantwort, Hormonsekretion, Muskelkontraktion und Knochenmineralisierung. Seine intrazelluläre Homöostase wird streng reguliert, wobei Transient Receptor Potential (TRP)-Kanäle eine Schlüsselrolle spielen. Der hochselektive Vanilloid-Typ Kanal TRPV6 vermittelt den transepithelialen Ca2+ -Transport und trägt wesentlich zur Ca2+ -Aufnahme bei. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss spezifischer Mutationen im Selektivitätsfilter sowie in der Calmodulin (CaM)-Bindedomäne auf die Funktion und Lokalisation von TRPV6 zu untersuchen. Punkt- und Doppelmutanten wurden mittels Polymerasekettenreaktion (PCR)-basierter Mutagenese und Klonierung hergestellt und in HEK293-Zellen exprimiert. Die funktionelle Analyse erfolgte über ein Nuclear Factor of Activated T-cells (NFAT)- Translokationsassay zur Bestimmung des Ca2+ -Einstroms sowie über KolokalisationsMessungen mit fluoreszierenden Markern der Plasmamembran (Farnesyl-5) bzw. Membran des endoplasmatischen Retikulums (KDEL). Die NFAT-Assays zeigten, dass die Mutationen E535K, D542A/S, G543C und A545D im Selektivitätsfilter eine starke Funktionsminderung bis hin zum Verlust der Aktivität verursachten. T539A/D und Y547H wiesen eine partielle Aktivität auf. Die Deletion der Carboxy-terminalen CaM-Bindestelle durch die Mutation W695X beeinflusste den Ca2+ - Einstrom nicht signifikant. Auffällig war, dass die Doppelmutante Y547H + W695X den Funktionsverlust von Y547H teilweise aufhob und eine NFAT-Lokalisation ähnlich dem Wildtyp vermittelte. Die Kolokalisations-Messungen zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen Mutanten und Wildtyp. Für W695X bestand lediglich eine nichtsignifikante Tendenz zu erhöhter Kolokalisation mit Farnesyl-5. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass Mutationen im Selektivitätsfilter die Aktivität von TRPV6 stark mindern bis hin zum Verlust der Aktivität, während W695X allein keinen signifikanten funktionellen Effekt zeigte. Die Kombination Y547H + W695X konnte den Funktionsverlust teilweise kompensieren. Weiterführende elektrophysiologische und bildgebende Analysen sind erforderlich, um die zugrunde liegenden Mechanismen detailliert aufzuklären.

Datum der Bewilligung	2025
Originalsprache	Deutsch (Österreich)
Betreuer/-in	Irene Frischauf (Betreuer*in)