Biomolecule micropatterns for quantification of protein-protein-interactions in living cells

Mikrostrukturierte Oberflächen bestehend aus immobilisierten Biomolekülen stellen ein einzigartiges und leistungsfähiges Instrument zur Untersuchung zellulärer Prozesse und biologischer bzw. biophysikalischer Abläufe dar.

In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene Methoden zur Herstellung dieser funktionellen Substrate entwickelt. Eine häufig verwendete Methode zur Herstellung von Mikrostrukturen ist microcontact printing (µCP). Diese Methode sowie ein alternativer photolithographischer Ansatz werden hier vorgestellt. Bei den meisten dieser Systeme werden Objektträger aus Glas als Substrat verwendet. Wir haben verschiedene Polymere untersucht, die als Alternative zu den herkömmlichen Materialien verwendet werden können. Darüber hinaus werden zwei verschiedene Möglichkeiten der Funktionalisierung von Polymeroberflächen beschrieben: funktionelle chemische Gruppen können entweder durch Plasmaaktivierung und anschließende Epoxysilan-Beschichtung oder mit einer kommerziell erhältlichen Polymer-Metallionen-Beschichtung (AnteoBindTM Biosensor-Reagenz) aufgebracht werden.

Weiters wurde die Eignung der verschiedenen Oberflächenmodifizierungsansätze durch in vitro Experimente in lebenden Zellen demonstriert. Ziel dieser Arbeit war es, bestehende Herstellungsverfahren für mikrostrukturierte Oberflächen zu verbessern und alternative Polymere zu untersuchen, die zur Herstellung von mikrostrukturierten Oberflächen verwendet werden können. Außerdem wurde der experimentelle Durchsatz mit diesen Oberflächen in Kombination mit 384-Well Mikrotiterplatten erhöht. Die Ergebnisse wurden in vier verschiedenen wissenschaftlichen Fachzeitschriften veröffentlicht.

/Fabrication, Characterization and Application of Biomolecule Micropatterns on Cyclic Olefin Polymer (COP) Surfaces with Adjustable Contrast. In dieser Arbeit wird über eine Methode zur Herstellung von mikrostrukturierten Oberflächen auf Folien aus zyklischen Olefinpolymeren (COP) mittels einer photolithographischen Methode berichtet. Es wird beschrieben, wie man diese Substrate herstellt, und wie man die Biomoleküldichte auf der mikrostrukturierten Oberfläche beeinflussen kann. Durch Variation der Plasmaaktivierungsparameter (Plasmaenergie und Behandlungsdauer) konnten wir die Deposition von Proteinen auf dem Polymer manipulieren. Die Validierung der Rezeptorinteraktionen in lebenden Zellen wurde mit immobilisiertem epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Jurkat-Zellen, die den EGF-Rezeptor exprimieren, getestet. Schließlich demonstrierten wir erfolgreich die Implementierung dieses Ansatzes zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) in lebenden Zellen mittels totaler interner Fluoreszenzmikroskopie (TIRF).

A Simplified and Robust Activation Procedure of Glass Surfaces for Printing Proteins and Subcellular Micropatterning Experiments. Diese Studie beschreibt ein vereinfachtes Aktivierungsverfahren für unbehandelte Glasoberflächen, das ohne zusätzliche physikalische und chemische Substratmodifikation auskommt: eine handelsübliche Polymer-Metallionenbeschichtung (AnteoBindTM Biosensor-Reagenz), die eine starke Anlagerung von Biomolekülen durch Avidität ermöglicht. Dieser Ansatz zur Oberflächenmodifizierung lässt sich einfach in die tägliche Laborroutine integrieren und kann auch auf Polymersubstrate übertragen werden. Die optimalen Konzentrationen der Lösung wurden getestet sowie die Bindungskapazität analysiert. Außerdem haben wir die Anwendbarkeit dieses Ansatzes für die Bewertung von PPIs in lebenden Zellen demonstriert. Diese Methode stellt eine substanzielle Vereinfachung des µCP-Prozesses dar und zeigt die Biokompatibilität der Oberfläche mit Micropatterning-Experimenten in lebenden Zellen und deren Charakterisierung mittels TIRF-Mikroskopie.

Microcontact printing of biomolecules on various polymeric substrates: limitations and applicability for fluorescence microscopy and subcellular micropatterning assays. In dieser Studie wird die Charakterisierung verschiedener Polymere für zelluläre Testsysteme in Kombination mit mikrostrukturierten Oberflächen und TIRF Mikroskopie beschrieben. Dazu haben wir elf verschiedene Polymerfolien in Bezug auf Plasmaaktivierung, Oberflächenfunktionalisierung, Mikrostrukturierung, Fluoreszenzmikroskopie und ihre Anwendbarkeit in Assays mit lebenden Zellen getestet. Die Einführung funktioneller Gruppen auf der Polymeroberfläche erfolgte durch Plasmaaktivierung und anschließende Epoxysilan-Beschichtung. Danach wurden die Mikrostrukturen mittels µCP hergestellt. Drei Polymersubstrate wurden als vielversprechende Alternativen zu herkömmlichen Glassubstraten identifiziert: zyklisches Olefinpolymer (COC), zyklisches Olefincopolymer (COP) und Polymethylmethacrylat (PMMA).

Subcellular Dynamic Immunopatterning of Cytosolic Protein Complexes on Microstructured Polymer Substrates. In dieser Arbeit zeigen wir eine Technik für dynamisches Immunopatterning von zytosolischen Proteinkomplexen. Dazu wurde eine Plattform auf Basis von 384-Well Mikrotiterplatten und COP-Substraten zur Detektion von Proteininteraktionen in lebenden Zellen entwickelt. Damit kann der experimentelle Durchsatz enorm gesteigert werden und eine Alternative zu Glasoberflächen wird präsentiert. Zu diesem Zweck verwendeten wir die mikrostrukturierte Oberfläche in Kombination mit künstlichen Transmembrankonstrukten. Es wurden Proteinarrays in lebenden Zellen hergestellt und zur Charakterisierung der Interaktion des Mediatorproteins Grb2 mit anderen Proteinen verwendet. Grb2 spielt eine wichtige Rolle bei der Signalübertragung nach Stimulierung des epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptors (EGFR). Mit dieser Technik konnten intrazelluläre Prozesse zur Signalübertragung mittels Totaler Interner Reflektion Fluoreszenz (TIRF) Mikroskopie analysiert werden.

Insgesamt werden in dieser Dissertation zwei verschiedene Methoden zur Herstellung von Mikrostrukturen auf Glas- und Polymersubstraten sowie die Analyse geeigneter Polymermaterialien für die Mikrostrukturierung und anschließende Fluoreszenzmikroskopie beschrieben. Darüber hinaus werden die Anwendbarkeit der Biochips zur Charakterisierung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen gezeigt.